检测步骤
Ι。活性Cdc42 Pull-Down实验
1. 等分0.5-1 mL的细胞裂解物至微量离心管中。
2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 缓冲液。
3. 向管中加入1ul的活性Cdc42单克l隆抗l体。
4. 用涡旋振荡仪将protein A/G凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。
5. 将管置于4°C条件下孵育1H，并轻轻的进行摇动。
6. 5000g，离心1分钟。
7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。
8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。
9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。
10. 用20ul的2X SDS-PAGE样品缓冲液重悬样品。
11. 样品煮沸5min。
12. 5000g，离心10s。
1.抗活性的Arl1，小鼠单克l隆抗l体（货号26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg/ ml），含有50％甘油和0.05％叠氮l化钠。该抗l体特异性识别所有脊椎动物的Arl1-GTP。
2.蛋白A / G琼脂糖（目录号30301）：一小瓶– 400 μL 50％浆液。
3. 5X测定/裂解缓冲液（目录号30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mMNaCl，50 mM MgCl2，Gao kit，5 mM EDTA，5％Triton X-100。
4.抗Arl1，小鼠单克l隆抗l体（目录号26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）
pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。
5. 100 XGTPγS（货号30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP标记的0.5 mL细胞裂解物。
6. 100 X GDP（产品目录号30304）：一个样品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP
GDP标记的0.5 mL细胞裂解物。
1.刺激的和非刺激的细胞裂解液
2.蛋白酶抑制l剂
3. 4°C管摇杆或摇床
4. 0.5 M EDTA，pH8.0
5. 1 M氯化镁
6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液
7.电泳和免l疫印迹系统
8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 MNaCl，0.05％Tween-20）
9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）
10. PVDF或硝l酸纤维素膜
11.二抗
12. ECL检测试剂
?1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mMPMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。
Arl3（类似Arf的3）是一种ADP-核糖基化因子（Arf）家族蛋白，在N端延伸方面不同于大多数Arf家族成员。Arl3的核苷酸交换是快速的，并且与脂质和去污剂无关。 与GDT /GTP结合后，Arl3与一系列效应蛋白相互作用，并调节这些效应蛋白的活性，例如人类视网l膜基因4（HRG4），cGMP磷酸二酯酶的δ亚基（PDEδ）和Arl2的结合物（BART）。Arl3还以可调节的方式结合微管，以通过与色素性视网l膜炎2（RP2）相互作用来改变胞质分裂的特定方面。有人提出，RP2与Arl3协同作用，将光感受器中的细胞膜和细胞骨架连接为细胞的一部分
9.收集上清液并在冰上存储样品（约1-2 mg总蛋白）以进行中间使用，或将其冷冻并保存在-70°C下以备将来使用。
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