1.抗活性的Arl1,小鼠单克l隆抗l体(货号26924):一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL(1mg/ ml),含有50%甘油和0.05%叠氮l化钠。该抗l体特异性识别所有脊椎动物的Arl1-GTP。
2.蛋白A / G琼脂糖(目录号30301):一小瓶– 400 μL 50%浆液。
3. 5X测定/裂解缓冲液(目录号30302):一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl,pH 8,750mMNaCl,50 mM MgCl2,5 mM EDTA,5%Triton X-100。
4.抗Arl1,小鼠单克l隆抗l体(目录号26056):一小瓶– 100 μL(1 mg / ml)
pH 7.4的PBS中含有50%的甘油。
5. 100 XGTPγS(货号30303):1瓶– 100 μl,10 mM,使用5 μLGTPγSGTP标记的0.5 mL细胞裂解物。
6. 100 X GDP(产品目录号30304):一个样品瓶– 100 μl,100 mM,使用5 μL GDP
GDP标记的0.5 mL细胞裂解物。
1.刺激的和非刺激的细胞裂解液
2.蛋白酶抑制l剂
3. 4°C管摇杆或摇床
4. 0.5 M EDTA,pH8.0
5. 1 M氯化镁
6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液
7.电泳和免l疫印迹系统
8.免l疫印迹洗涤缓冲液,例如TBST(10 mM Tris-HCl,pH 7.4,0.15 MNaCl,0.05%Tween-20)
9.免l疫印迹封闭缓冲液(TBST包含5%脱脂奶粉或3%BSA)
10. PVDF或硝l酸纤维素膜
11.二抗
12. ECL检测试剂
?1X测定/裂解缓冲液:短暂混合5X储备液,并在去离子水中稀释至1X。 在使用前,添加蛋白酶抑制l剂,例如1 mMPMSF,10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。
试剂制备
1X Assay/LysisBuffer:实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液,并在使用前加入蛋白酶抑制l剂如1 mMPMSF, 10 μg/mL leupeptin(亮肽素),或 10 μg/mL aprotinin(抑肽酶)。
样品处理
贴壁细胞
1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间(直径10 cm培养皿,~107个细胞),并用活性剂或抑制l剂进行处理。
2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。
3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液(每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL)。
4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。
5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。
6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
7.如果核发生裂解,细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时,将细胞裂解物用27?的注射l器针头来回吸取3-4次,以破坏基因组DNA,从而避免上述情况的出现。
8. 4°C 12000 g, 离心10 min。
9. 收集上清(~1-2 mg总蛋白)并放置于冰上使用。如果样品不立即使用,请将处理后的样品存放于-70°C条件下。
电泳和转移
1向聚丙l烯酰胺凝胶(17%)中加入15μL/孔的下拉上清液。而且建议包括预染色MW标准(作为成功转入的指标步骤3)。
2按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
3按照制造商的说明,将凝胶蛋白转移到PVDF或硝化纤维膜上说明。
免l疫印迹检测(所有步骤均在室温下搅拌)
1在电印迹步骤之后,将PVDF膜浸入甲l醇中15次
然后在室温下干燥5分钟。
如果使用硝基纤维素,则应跳过此步骤。
2室温下用5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在TBST中封闭1小时
不断地搅动。
用抗Arl1单克l隆抗l体孵育,新鲜稀释1:50~1000
(取决于样品中Arl1蛋白质的含量)5%脱脂奶粉或3%
BSA/TBST,室温下持续搅拌1-2小时或4o
过夜。
3用TBST清洗吸水膜三次,每次5分钟。
4用二级抗l体(例如山羊抗鼠IgG,HRP结合物)培养膜,
在室温下,Gaz 蛋白,在5%脱脂奶粉或3%BSA/TBST中新鲜稀释1:1000,1小时
不断地搅动。
5用TBST清洗吸水膜三次,每次5分钟。
6使用您选择的检测方法,如ECL。
Gaz蛋白-武汉纽斯特生物公司(图)由武汉纽斯特生物技术有限公司提供。武汉纽斯特生物技术有限公司为客户提供“G蛋白活性,cAMP和cGMPELISA试剂盒,蛋白点突变”等业务,公司拥有“纽斯特”等品牌,专注于生物化工等行业。,在湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道666号光谷生物城B3-3栋3楼的名声不错。欢迎来电垂询,联系人:黄经理。