当前没有直接测定法来测量Arl1 GTPases的激l活。
NewEast BiosciencesArl1激l活检测试剂盒基于特定于配置的单克l隆抗l体,该抗l体特异性识别Arl1-GTP,但不能识别Arl1-GDP。鉴于单克l隆抗l体对其抗原的高度亲和力,可以在短时间内进行激l活测定。 该测定法可提供可靠的结果,并具有一致的可重复性。
电泳和转膜
1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。
2. 按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到PVDF或硝化纤l维素膜。
免l疫印迹反应和检测(所有步骤都是在室温下进行,Sar1-GTP,并不断搅拌)
1. 将PVDF膜浸入甲l醇15s,然后在室温放置5 min晾干。
注意:如果使用的是硝化纤l维素膜,此步省略。
2. 封闭:用TBST缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%BSA在室温下孵育1H进行封闭,并需要恒定振荡。
3.孵育一抗:用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA稀释特异性识别Cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体(稀释比例为1:50-1:1000,主要根据样品中含有的Cdc42蛋白的量),室温下孵育1-2小时,或者4°C条件下过夜孵育。
4. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
5.孵育二抗:(例如羊抗兔IgG-HRP),用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA按1:1000稀释比例稀释后使用,室温下孵育1小时并恒定振荡。
6. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ECL显色法。
小G蛋白是从属于细胞调节因子中的一个超家族。Rho家族是小G蛋白中的一个亚家族,它在细胞运动、细胞分裂以及基因转录中发挥主要作用。而本试剂盒中的Cdc42就属于Rho亚家族中的一种,Cdc42参与生理活动过程中其分子结构会呈现出2种相互转换的形式:与GTP结合的激l活状态和与GDP结合的非活性状态。
目前Cdc42蛋白活性的检测主要是依据小GTP酶Cdc42可以与p21活化激酶(PAK)的p21结合区域(PBD)结合,使PAK活化从而发挥生物学功能,进而间接的进行Cdc42活性l功能的监测。然而此方法在检测过程中存在着一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度过快以及Cdc42-GTP结合蛋白与p21结合区域之间较低的亲和力,导致这种检测方法的重复性较差。
武汉纽斯特(多图)-Sar1-GTP由武汉纽斯特生物技术有限公司提供。武汉纽斯特生物技术有限公司为客户提供“G蛋白活性,cAMP和cGMPELISA试剂盒,蛋白点突变”等业务,公司拥有“纽斯特”等品牌,专注于生物化工等行业。,在湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道666号光谷生物城B3-3栋3楼的名声不错。欢迎来电垂询,联系人:黄经理。