蛋白酶活力的测定福林法
B.1原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下,水解酪蛋白底物,产生含有酚基的氨基酸(如:酪氨酸,色氮酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Folin)还原,生成钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长680nm下测定溶液的吸光度。酶活力与吸光度成比例,由此可以计算产品的酶活力。
B.2仪器和设备
B.2.1 分析天平:精度为0.000 1 g.B.2.2紫外-可见分光光度计。
B.2.3恒温水浴:精度士0.2 ℃.B.2.4 pH计:精度为0.01pH单位。
B.3试剂和溶液
除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。B.3.1福林(Folin)试剂
于2 000 mL磨口回流装置中加入钨酸钠(NagwO·2HO)100.0 g、钼酸钠(NagMoO。·2H,O)25.0g,水700 mL,85%磷酸50 mL,浓盐酸100 mL。小火沸腾回流10 h,取下回流冷却器,在通风橱中加入硫酸锂(LiaSO)50 g,水 50 mL和数滴浓溴水(99%),再微沸15min,以除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水,再煮沸除去过量的溴),冷却,加水定容至1 000mL。混勾,过滤。制得的试剂应呈金黄色,贮存于棕色瓶内。
B.3.2福林使用溶液
一份福林试剂与两份水混合,摇匀。也可使用市售福林溶液配制。B.3.3碳酸钠溶液(42.4 g/L)
称取无水碳酸钠<NazCO,)42.4g,用水溶解并定容至1 0o0 mL.B.3.4三氯乙酸(65.4 g/L)
称取三氯乙酸65.4 g,用水溶解并定容至1 0o0 mL.B.3.5氢氧化钠溶液(20 g/L)
称取氢氧化钠片剂20.0 g,加水900 mL并搅拌溶解。待溶液到室温后续水定容至1 000 mL,搅拌均匀。
B.3.6盐酸溶液:c(HCI)= 1 mol/L及0.1 mol/L
按GB/T 601配制。
B.3.7缓冲溶液
除以下蛋白酶的溶解/稀释缓冲体系外,生产者和使用者还可以探讨使用其他适用的缓冲体系。以下各种缓冲溶液配制时需用pH计测定并调整pH值。
B.3.7.1磷酸缓冲液(pH=7.5,适用于中性蛋白酶制剂)
分别称取磷酸氢二钠(NaHPO·12H,O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH,PO。· 2H,O)0.5 g,加水溶解并定容至1000 mL。
