色谱分离原理
液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
1.液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。
2.液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。
涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、基柱和柱。
反相色谱(RPC)是指利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶1剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。与HIC一样，RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性。因此，必须用极性有机溶1剂或其水溶液进行溶质的洗脱分离。溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。当固定相一定时，可以通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。RPC主要应用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可以用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶1剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活，所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。
色谱柱是HPLC系统非常关键的一部分，随着色谱技术的发展，它也不断地更新换代，长度变得越来越短，填料颗粒也越来越细。现在常用的色谱柱长度在30～250mm，颗粒直径在1.6～5μm。颗粒类型主要有全多孔和表面多孔，全多孔填料具有更大的柱容量、更多键合相选择的优点，表面多孔具有反压低、峰形好的优点。的基质是硅胶。以前填料纯化技术不是很成熟，十八烷基键合到硅胶表面不是很完全，硅胶上总是少量的硅羟基在外面。这样就造成样品在进行色谱分离的时候，会吸附或者键合在这部分硅羟基上，导致色谱峰拖尾。使用三乙胺作为封尾剂，与硅羟基吸附，可以使峰型改善，这个三乙胺曾经一度成为分析界的宝贝和。现在，层析泵，制造填料的技术日趋成熟，人们已经掌握了把这部分剩余未键合硅胶也进行键合钝化的技术，这个技术就叫作封尾。
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