植物组织原位杂交的步骤包括以下几个方面:
1. 制备组织样品:从植物中取出需要研究的组织样品,如根、茎、叶等。
2. 固定组织样品:将组织样品固定在载玻片上,通常使用或乙醇等化学物质进行固定。
3. 处理组织样品:对固定的组织样品进行脱水、透明化、脱脂等处理,以便于DNA探针的穿透和结合。
4. 制备DNA探针:根据需要研究的基因序列,设计并合成DNA探针。DNA探针可以标记荧光染料或性同位素,以便于检测。
5.杂交DNA探针:将DNA探针与组织样品进行杂交,动物组织原位杂交,通常需要在高温下进行,以便于DNA探针与RNA或DNA结合。
6.检测杂交信号:通过荧光显微镜或计数器等设备,检测DNA探针与RNA或DNA的结合情况,确定目标基因的表达模式和位置。
杂交 (1) 盛有2×SSC的塑料盘同,原位杂交,将干烤的滤膜飘浮在液面上,浸湿5分钟。(2)将滤膜转到200ml预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起,原位杂交试剂,放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿,放到位于培养箱内的旋转平台上。于50℃处理30分钟。在这一步及以后的所有步骤中,应缓缓摇动滤膜,防止它们粘在一起。(3)用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片,以降低杂交背景而不影响阳性杂交信号的强度和清晰度。(4)将滤膜转到盛有150ml预杂交液的玻璃中,在适宜温度(即在水溶液中杂交时用68℃,而在50%甲酰胺中杂交时用42℃)下,预杂交1-2小时。
怎样保证原位杂交实验操作时的温度?
建议仪器操作,人工操作的话要注意:
(1)对荧光原位杂交操作过程中可能使用的一些仪器进行温控检查,不符合要求的进行更换。
(2)尽可能地保持环境温度在20度以上。
(3)针对需要预热以达到要求温度的试剂,在使用前必须使用温度计对其进行测温。
(4)同时检测的样本不超过4块,植物组织原位杂交,操作一定要迅速,实验人员要注意一些小部件的温度,尤其是在冬季。
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