1. VASP通过调节Rab11依赖性TGF-β受体的质膜靶向来促进肝星状细胞的TGF-β活化
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2. Rab5活性调节GLUT4分类为胰岛素反应性和非胰岛素反应性内体室:胰岛素抵抗发展的潜在机制。
内分l泌学。 2014年9月; 155(9):3315-28
将裂解液转移到适当大小的试管中,并置于冰上。
如果发生核裂解,则细胞裂解液可能变得非常粘稠,难以移液。如果发生这种情况,可将裂解液通过27?号注射l器针头3-4次以剪切基因组DNA。
通过离心10分钟(在4°C下为12,000 x g)清除裂解物。
收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用,或速冻并保存在-70°C以便将来使用。
储存条件
试剂盒的成分在试剂盒的有效期限内必须存放于4°C条件下保存。
试剂(试剂盒内不提供,由实验者自行配置)
1. 刺激和未刺激的细胞裂解物;
2. 蛋白酶抑制l剂;
3. 4 °C 摇杆或者摇床;
4. 0.5 M EDTA (pH 8.0);
5. 1 M MgCl2;
6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer;
7. 电泳和免l疫印迹相关试剂;
8. 免l疫印迹缓冲液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl,0.05%
Tween-20);
9. 免l疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA);
10. PVDF或硝l酸纤维素膜;
11. 二抗;
12. ECL 检测试剂;
电泳和转膜
1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。
2. 按照制造商的说明进行SDS-PAGE。
3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到PVDF或硝化纤l维素膜。
免l疫印迹反应和检测(所有步骤都是在室温下进行,Rac kit,并不断搅拌)
1. 将PVDF膜浸入甲l醇15s,然后在室温放置5 min晾干。
注意:如果使用的是硝化纤l维素膜,此步省略。
2. 封闭:用TBST缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%BSA在室温下孵育1H进行封闭,并需要恒定振荡。
3.孵育一抗:用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA稀释特异性识别Cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体(稀释比例为1:50-1:1000,主要根据样品中含有的Cdc42蛋白的量),室温下孵育1-2小时,或者4°C条件下过夜孵育。
4. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
5.孵育二抗:(例如羊抗兔IgG-HRP),用TBST缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%BSA按1:1000稀释比例稀释后使用,室温下孵育1小时并恒定振荡。
6. 用TBST缓冲液洗涤膜三次/5min。
7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ECL显色法。
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